Tham gia quá trình dịch mã có tRNA và rRNA RNA với vai trò xúc tác : ribozyme
Điều hoà biểu hiện gene: RNAi
Slide 3
Slide 4
|
I. Giới thiệu
Theo học thuyết trung tâm của sinh học phân tử: DNA sao chép sau
đó phiên mã tạo ra mRNA và từ mRNA dịch mã tạo ra protein. Trong các quá
trình sao chép, phiên mã và dịch mã đều có sự tham gia của các loại RNA khác
nhau với nhiều vai trò khác nhau. Ví dụ như: mRNA đóng vai trò truyền đạt
thông tin di truyền
Tham gia quá trình dịch mã có tRNA và rRNA RNA với vai trò xúc tác
: ribozyme
Điều hoà biểu hiện gene: RNAi
Cơ thể con người chứa rất nhiều loại tế bào khác nhau. Trong mỗi
tế bào ko phải tất cả các gen đều được biểu hiện, mỗi loại tế bào sẽ biểu
hiện gen khác nhau. Các tế bào thần kinh biểu hiện gen khác với các tế bào cơ
hoặc tế bào gan. Đối với việc phân chia tế bào, nhân đôi DNA thì có các điểm
kiểm soát ở các giai đoạn G1, G2 và S. Đối với gen, gen nào hoạt động ở thời
điểm nào được điều chỉnh bởi các yếu tố điều hòa biểu hiện gen, có điều hòa
biểu hiện gen trước phiên mã và sau phiên mã. Quá trình điều hòa sau phiên mã
có sự tham gia của RNAi.
“RNA can thiệp” (RNAi) giúp kiểm soát các gen đang hoạt động. Đó
là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gen có trình tự bổ
sung với nó thông qua việc ức chế dịch mã, phân giải mRNA. Việc điều hòa biểu
hiện gen của RNAi gồm nhiều thành phần
tham gia
nên nó là một hệ thống bên trong các tế bào.
|
Slide 5
Slide 6
Slide 7
|
Bên cạnh chức năng điều hòa biểu hiện gen, RNAi còn có vai trò
trong bảo vệ tế bào chống lại gen ký sinh, virus và gen nhảy (transposon).
Điều này là do RNAi sử dụng chính trình tự nucleotide để tắt gen (im lặng),
dẫn tới khả năng kháng được cả acid nucleotide nội sinh và acid nucleotide
bên ngoài.
Ví dụ khi virus xâm nhiễm vào tế bào, chúng giải phóng genome bộ
gen của chúng để xâm nhiễm hệ thống RNAi sẽ ức chế, phân cắt chúng trước khi
genome của chúng tích hợp vào bộ gen của tế bào chủ.
RNAi có 2
loại là miRNA và siRNA.
Lịch sử phát triển RNAi
1990
Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R quan sát thấy
hiện tượng ức chế lẫn nhau giữa mRNA nội sinh và biến đổi gen từ thí nghiệm
tạo ra petunias với màu tím đậm hơn. Hiện tượng ức chế đồng thời được gọi là
sự im lặng gen sau phiên mã (PTGS)
1995 Guo S, and Kemphues
K J nhận thấy anti-senseRNA có hiệu quả trong
việc ức chế sự biểu hiện của gen par-1 trên loài C. Elegans. Họ tiêm
anti-senseRNA vào C.elegans để làm im lặng gen. Mặc dù kiểm soát âm của họ
cũng cho thấy sự ức chế gen trung gian, nhưng nó vẫn là một phát hiện đáng
chú ý.
1998 Fire et al mô tả quá trình can thiệp RNA ở C,elegans. Họ không chỉ sử dụng
sense or anti-senseRNA mà còn sử dụng cả dsRNA để kìm hãm sự biểu hiện của
gen trong C.elegans. Thí nghiệm này cho thấy việc dùng dsRNA để im lặng gen
hiệu quả hơn việc chỉ dùng sense or anti-senseRNA 10 lần. Qui trình này đưa
ra kỷ nguyên RNAi.
2000 Zamore et al khám phá qui trình sử dụng enzyme Dicer để cắt các đoạn dsRNA dài
thành các đoạn nhỏ trong Drosophila
2001 Elbashir S M et al.
Lần đầu tiên mô tả sự hiện diện của RNAi trong tế
bào động vật hữu nhũ. Rất khó để thực hiện được RNAi trong tế bào động vật có
vú vì phản ứng interferon mạnh gây ra bởi dsRNA dẫn đến ức chế sự biểu hiện
toàn bộ gen hoặc gây chết tế bào. Cuối cùng họ cũng tìm được cách phân hủy
các mRNA trình tự đặc biệt mà không cảm ứng đáp ứng mạnh của interferon bằng
cách đưa vào các đoạn mạch đôi 20-21nt gọi là siRNA. Hiện nay, các nghiên cứu
này như là một công cụ mạnh để kìm hãm một gen mong muốn trong động vật hữu
nhũ nhanh chóng và chọn lọc.
2002 McCaffrey et al. cho thấy sự ức chế biểu hiện của gen, trong chuột trưởng thành
bằng siRNA và RNA kẹp tóc nhỏ được sao chép từ DNA (miRNA). Khả năng sử dụng
kỹ thuật này cũng được đề cập đến bằng cách chứng minh có hiệu quả nhắm mục
tiêu của một trình tự từ virus viêm gan C do can thiệp RNA in vivo.
2003 Paddison, Sui, Paul et al. nhận thấy rằng RNA kẹp tóc ngắn hoạt động như dsRNA và
|
Slide 8
Slide 9
Slide 10
Slide 11
|
có thể gây ra sự im lặng của
trình tự đặc hiệu ở động vật có vú.
2003 Song et al. báo cáo rằng ARN can thiệp nhỏ có thể được sử dụng điều trị ở động
vật có vú.
Chỉ trong vòng khoảng 15 năm nghiên cứu về RNAi thì vào năm 2004 Acuity Pharmceuticals đã thử nghiệm
lâm sàng về thuốc siRNA cho bệnh thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi tác
(AMD)
2006 Giải Nobel sinh lý và y học được trao cho hai nhà khoa học Andrew
Z. Fire và Craig C. Mello về việc khám phá ra cơ chế RNAi – im lặng gen bởi
RNA sợi đôi (dsRNA)
Thí nghiệm của Andrew và Craig.
Hính 1: Đưa các phân tử mRNA (sợi sense) mã hoá một protein cơ,
kết quả cho thấy không làm thay đổi hành vi của giun tròn. Tương tự như khi
tiêm antisense cũng không tháy hiện tượng gì. Nhưng khi Fire và Mello tiêm cả
sợi đôi của RNA này vào cơ thể giun tròn, thấy giun có những chuyển động lạ,
cụ thể là co giật.
Các hành vi tương tự cũng xảy ra ở những con giun đã knock out gen
chịu trách nhiêm tạo protein cơ.
Hình 2. RNAi ảnh hưởng lên hàm lượng mRNA mex-3 trong phôi. Mex-3
mRNA có rất nhiều trong tuyến sinh dục và phôi sớm Sau khi tiêm RNA mex-3
mạch đơn hoặc mạch đôi một vào tuyến sinh dục C. Elegans. Các mRNA bị mất sau khi tiêm RNA kép, trong khi tiêm
RNA antisense chỉ làm giảm mRNA đến một mức độ nào đó kết quả được thể hiện
qua mức độ màu, màu càng đậm phản ánh lượng mRNA hiện diện càng nhiều.
II. Cơ chế Môt số
thuật ngữ miRNA: micro RNA
siRNA: small 3nterfering RNA Guide strand: antisense strand
Passenger strand: sense strand
RISC: RNA – incluced silencing complex (phức hệ tắt gene cảm ứng
bởi RNA) Dicer: Rnase III
Drosha:
RNAse III
Ago: ARGONAUTE, họ
protein kết hợp với các sRNA bao gồm siRNA và miRNA, có khối lượng phân tử 95
tới 100kDa.
Cơ chế chung
của RNAi
Trong tế bào
chất các dsRNA bị Dicer cắt thành các đoạn nhỏ
" Các đoạn dsRNA nhỏ này gắn với một phức hợp protein
|
Silde 12
|
" Một mạch RNA bị loại bỏ, mạch còn lại kết hợp với phức hợp protein
tạo thành RISC
" RISC dùng mạch RNA còn lại như là mẫu dò để gắn với một phân tử mRNA
đích – (có trình tự bắt cặp bổ sung mạch RNA).
" Phân tử target mRNA bị tách mạch và bị phân hủy.
" ko có sự hình thành protein
" Gen bị im lặng (tắt)
1. Con đường siRNA – RNA nhỏ can thiệp (small interfering RNA)
+ Quá trình
hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma)
+ Cơ chế này cho phép các sinh vật can thiệp vào trình tự gen
ngoại lai trước khi nó có thể tích hợp vào bộ gen của vật chủ và phá hủy nó
+ dsRNA (double strand RNA) ngoại lai sẽ
bị Dicer (và DGCR 8) cắt thành những đoạn mạch đôi nhỏ từ 20 – 25 nu với 2
nucleotide ở đầu 3’ nhô ra gọi là siRNA(có
kích thước thích hợp để nạp vào protein Argonaute)
" Tiếp theo, dsRNA được mang đến Argonaute, nhờ phức hợp các
protein
(Phức hợp này gồm Dicer, Argonaute, dsRBP – làm nhiệm vụ cắt dsRNA
và mang nó đến Argonaute )
" Ở
đây xảy ra quá trình chọn mạch, một mạch của mạch đôi gắn với Argonaute, mạch
kia bị phân hủy. (mạch bị phân hủy là passenger strand, mạch được giữ lại là
guide strand)
" Argonaute
gắn với RNA guide strand " RISC (RNA-induced silencing complex)
RISC sử dụng RNA guide strand như mẫu dò để gắn với mRNA đích có
trình tự bổ sung với RNA guide strand
" phân hủy mRNA " ngăn cản quá trình dịch mã
2. Con đường miRNA (micro RNA)
+ Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear) và
trong tế bào chất (cytoplasma)
+ Các phân tử miRNA có nguồn gốc từ các phân tử miRNA nguyên thuỷ
(pri- miRNA) được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gene bên trong
nhân tế bào, các phân tử này có chứa các cấu trúc kẹp tóc (hairpin);
"
Các phân tử pri-miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi
Pre-miRNA, dài khoảng 65 – 70nu " phân tử tiền microRNA;
" Các phân tử Pre- miRNA sẽ được Exportin-5 di chuyển ra ngoài tế
bào chất;
" Pre- miRNA
sau khi được di chuyển ra ngoài tế bào chất
"
enzyme Dicer cắt thành những đoạn dsRNA nhỏ (khoảng 19 – 21 nu); Giống như
con đường siRNA,
|
Slide 13
Slide 14
|
" dsRNA được mang đến Argonaute, nhờ phức hợp các protein
"
Xảy ra quá trình chọn mạch, một mạch của mạch đôi gắn với Argonaute, mạch kia
bị phân hủy.
" Argonaute gắn với ssRNA " RISC (RNA-induced silencing
complex)
" RISC gắn với
mRNA đích (đang dịch mã)
" Phân hủy
mRNA đích
" Kìm hãm quá
trình dịch mã
Các cơ chế ức chế qua trung gian miRNA – phức hợp
miRISC
Khi miRISC (phức hợp cảm ứng im lặng gen
qua trung gian miRNA) chưa gắn vào mRNA các nhân tố khởi sự phiên mã và các
tiểu phần của ribosome được huy động đến mRNA để khởi sự quá trinh dịch mã
(hình trên cùng)
Khi miRISC gắn vào mRNA, quá trình dịch mã bị kìm hãm bằng một số
cách (các hình bên dưới)
+ Ngăn cản quá trình gắn cap
+ Ngăn cản
tiểu phần 60S của ribosome, nhân tố phiên mã eIF6 gắn vào mRNA
+ Khử đuôi
poly A
+ Làm cho
ribosome sớm rời khỏi mRNA
+ Phân hủy
mRNA bằng cách khử đuôi poly A sau khi khủ cap
- dsRNA: các RNA mạch
đôi có đầu 3’ nhô ra 2 nu
+ Cấu tạo nhô ra không làm thay đổi kích thước sản phẩm phân cắt,
trình tự nucleotide đóng vai trò quyết định hiệu quả của Dicer.
+ Cấu trúc nhô ra có chứa C và A ở vị trí gần cuối và vị trí cuối
(tương ừng) được xử lý hiệu quả nhất, trong khi những cấu trúc có chứa A ở vị
trí gần cuối và U ở vị trí cuối là những chất ít tối ưu.
+ Số lượng
nucleotide ở phần nhô ra là một yếu tố quan trọng trong độ đặc hiệu Dicer
+ Dicer sử dụng đầu 3’ nhô ra để đếm vị trí cắt dsRNA, thành các
đoạn nhỏ, nhưng nế đầu nhô ra vượt quá 3 nu, Dicer không còn sử dụng đầu 3’
nhô ra để xác định vị trí cắt
"
có ý nghĩa đối với thiết kế siRNA và shRNA. Các thành phần tham gia cùng RNAi
Phức hợp Microprocessor gồm Drosha và DGCR8
a.
Cấu trúc các vùng của phức
hợp vi xử lý người gồm Drosha và DGCR8. Các vùng có nhiều proline (P),
arginine và serine (R + S), hoặc tryptophan (W) được đánh dấu.
b. Cấu trúc tinh thể của lõi DGCR8
.
DGCR8 có 2
vùng gắn với dsRNA (dsRBD1,2), chịu trách nhiệm cho việc xác định vị trí cắt
|
Slide 15
Slide 16
Slide 17
Slide 18
|
của Drosha, cố định dsRNA, chỉ tương tác với dsRNA, ko tương tác
với ssRNA DGCR8 (Pasha ở đv ko xương sống) nhận ra điểm giao giữa thân
pri-RNA và loop, và ssRNA " giúp Drosha xác định vị trí cắt, 11 bp từ junction "
pre-RNA 65 – 70 nu
Dicer: là một endoribonulease trong họ Rnase III (class 3), có chức năng
cắt dsRNA và pre- miRNA thành những đoạn dsRNA ngắn gọi là siRNA, dài khoảng
20 – 25 nucleotide. Dicer xúc tác bước đầu tiên trong con đường RNAi và khởi
đầu sự hình thành RNA-induced silencing complex.
+ Các
vùng cấu trúc của Dicer
+ Cấu trúc
chung của Dicer người.
+ Vùng PAZ: Vùng PAZ chịu trách nhiệm nhận biết đầu 3’ nhô ra 2 nu
của guide strand , có vai trò trong tách mạch
+ Vùng helicase định hướng
dsRNA tới trung tâm hoạt động Rnase IIIa / b và vùng PAZ
RNA- induced silencing complex (RISC)
RISC-loading complex là một phức hợp gồm Argonaute + Dicer + dsRBP (dsRNA-binding
protein) – TRBP (TAR RNA-binding protein), trong đó quan trọng nhất là
Argonaute.
Có vai trò vận chuyển dsRNA
đến RISC.
TRBP (TAR
RNA-binding protein): có hai vùng gắn với dsRNA
Dicer gắn với TRBP để tăng cường hiệu quả vận chuyển dsRNA (đã
được xử lý bởi Dicer) đến Argonaute.
Chức năng quan trọng của
Argo là nhận ra guide strand, tách mạch mRNA đích, huy động các protein cho
việc im lặng gen.
Gồm các vùng N-terminal, PAZ,
MID, PIWI
Vùng PAZ chịu trách nhiệm nhận biết đầu 3’ nhô ra 2 nu của guide
strand, giống vùng PAZ của Dicer; neo giữ đầu 3’ nhô ra 2 nu của guide
strand. Ít có ái lực với đầu 5’của nhiều dsRNA trong RNAi.
Đầu 5’ của guide strand (nằm giữa MID và PIWI) được giữ bởi 1 túi
(poket) giữa vùng MID và vùng PIWI, (giống như điểm neo giữ DNA của protein).
Mở ra “vùng hạt giống” 2-8 nuc trên siRNA guide, để ghép cặp base với mRNA
đích bổ sung. Sự kết hợp bổ sung thường xảy ra ở vùng hạt giống (2-7 nuc của
đầu 5 ‘) của miRNA và UTR 3’ của mRNA đích, cắt tại vị trí giữa nuc 10 và nuc
11.
Sự khác nhau giữa miRNA và siRNA
|
Slide 19
Slide 20
Slide 21
|
miRNA
|
siRNA
|
|||
Vị trí hình thành
|
Trong nhân và tế bào chất
|
Tế bào chất
|
|||
Nguồn gốc
|
Tiền miRNA (Pre-miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng (stem-loop) hay
dạng
kẹp tóc (hairpin)
|
Từ dsRNA có cấu trúc là chuỗi xoắn kép
|
|||
Chiều dài
|
19 – 25 nu
|
21 – 22 nu
|
|||
Bắt cặp bổ sung
với gen mục tiêu
|
Bắt cặp bổ sung không hoàn
toàn gen
mục tiêu
|
Bắt cặp bổ sung hoàn
toàn với gen
mục tiêu
|
|||
(a) siRNA bắt cặp bổ sung hoàn toàn cho vùng mã hóa của mRNA đích;
(b)
miRNA bắt cặp bổ sung với
mRNA mục tiêu của nó. Sự kết hợp bổ sung thường xảy ra ở vùng hạt giống
(nucleotide (nt) 2-7 ở đầu 5 ‘) của miRNA và vùng 3’ UTR của mRNA đích. Sự đa dạng của các nguồn siRNA
Các dsRNA có thể có nguồn gốc từ bên trong hoặc bên ngoài tế bào.
Chúng đều bị Dicer cắt thành các đoạn dsRNA nhỏ gọi là siRNA. Các siRNA có
thể có cấu trúc bắt cặp bổ sung hoàn toàn hoặc không hoàn toàn (các RNA có
cấu trúc kẹp tóc, pseudogene). Các đoạn dsRNA nhỏ này đều được đưa vào con
đường siRNA như đã trình bày ở các slide trước
Ở nhiều loài, các siRNA có thể được khuếch đại bởi sự hoạt động
của enzym RNA- dependent RNA polymerase (RdRP) làm tăng cường và kéo dài đáp
ứng im lặng
Ngoài con con đường siRNA và miRNA, ở động vật hữu
nhũ có thêm con đường piRNA
a. Con đường siRNA
- Có 2 nguồn
siRNA:
+ Nội bào (endo-siRNA):
có nguồn gốc từ dsRNA, cấu trúc stem-loop dài bên trong nhân tế bào như
pseudogene, transposon " được vận chuyển ra tế bào chất " được cắt
thành các đoạn siRNA bởi Dicer-TRBP hoặc Dicer-PACT vẫn chưa được rõ(???) "
được vận chuyển đến AGO2; đến AGO 1, AGO 3, AGO 4 vẫn chưa được rõ(???)
+ Ngoại bào (exo-siRNA): có nguồn gốc từ các dsRNA bên ngoài tế
bào chất " được cắt thành các đoạn siRNA bởi Dicer-TRBP hoặc Dicer-PACT vẫn chưa được rõ(???) "
được vận chuyển đến AGO2; AGO 1, AGO 3, AGO 4, nhưng chỉ AGO 2 có chức năng
Slicer
b.
Con đường miRNA
Giống các sinh vật khác, chỉ khác: pre-miRNA được cắt bởi Dicer-TRBP hoặc Dicer- PACT, miRNA hoàn
chỉnh được vận chuyển đến AGO2; AGO 1, AGO 3, AGO 4.
c.
Con đường piRNA
piRNA (24-32
nu) có nguồn gốc từ ssRNA (RNA mạch đơn)
pri-piRNA
không bị cắt bởi Dicer (vai trò của Drosh chưa rõ), chúng được xử lý bởi con
|
|||||
Slide 22
Slide 23
Slide 24
Slide 25
Slide 26
đường “ping pong”, trong đó ARN mục tiêu của một protein Piwi bị cắt
và trở thành RNA dẫn đường của một protein Piwi khác, với vai trò cắt thuộc về
PIWI.
MIWI2 (một protein giống PIWI) liên kết với piRNA và định vị nó
trong nhân để thực hiện chức năng im lặng của nó.
III. Ứng dụng RNAi
Như mọi người đều biết bệnh hiện nay chủ yếu liên quan đến gen: đột
biến hay gen biểu hiện bất thường. Cơ chế RNAi cho thấy chúng có thể tác động
đến việc biểu hiện của các gen, nên chúng ta có thể dựa vào điều này để ứng
dụng cho việc ức chế sự biểu hiện của các gen sai hỏng,
Dựa vào nguyên tắc trên chúng ta tạo ra các siRNA hay miRNA và đưa
vào cơ thể người để điều chỉnh lại sự biểu hiện gen.
RNAi được ứng dụng vào rất nhiều loại bệnh trong đó có ung thư, bệnh
về mắt, bệnh nhiễm, tim mạch, rối loạn biến dưỡng…
Biểu đồ về tỷ lệ các bệnh được sử dụng RNAi điều trị và đang được
thử nghiệm lâm sàng (2015)
Tính chất
|
Các phân tử nhỏ
|
Thuốc protein
|
Thuốc siRNA/miRNA
|
Hoạt tính tự
nhiên
|
Kích hoạt hay ức chế mục
tiêu
|
Kích hoạt hay
ức chế mục tiêu
|
Ức chế mục tiêu
|
Vị trí nhắm
mục tiêu
|
Ngoại bào và nội bào
|
Chủ yếu là
ngoại bào
|
Hầu như bất kỳ vị trí
nào
|
Tính chọn lọc và hiệu
nghiệm
|
Đa dạng (dựa vào vị trí gắn và đặc hiệu thụ thể, ái lực
và hiệu quả của chúng)
|
Đặc hiệu cao và mạnh
|
Đặc hiệu cao và mạnh
|
Tác động
|
Chậm
|
Chậm
|
Nhanh chóng
|
Sản xuất
|
Dễ
|
Khó
|
Dễ
|
Ổn định
|
Ổn định
|
Không ổn định
|
Không ổn định
|
Phân phối
|
Dễ
|
Khó
|
Khó
|
Xây dựng thuốc RNAi
Thiết kế RNAi:
lựa chọn siRNA hay miRNA.
Tăng tính bền của RNAi bằng cách thực hiện các biến đổi hóa học.
Chọn phương pháp phân phối thuốc vào cơ thể.
Việc xây dựng thuốc phải giải quyết được các yêu cầu đặt ra Yêu cầu
tránh việc tác động ngoài mục tiêu.
Việc lựa chọn trình tự không đặc hiệu sẽ dẫn tới việc
tác động vào các gen không “chủ đích”,
Slide 27
Slide 28
Slide 29
bên cạnh đó miRNA chỉ cần bổ sung một phần để tác động đến biểu hiện
gen điều này càng làm tăng khả năng tác động vào các gen khác. do đó nếu không
cẩn thận do đặc tính chỉ cẩn bổ sung các hiệu ứng không mong muốn siRNA xảy ra
thông qua sự bổ sung một phần của siRNA với các mục tiêu mRNA không mong muốn.
Đối với siRNA tùy thuộc vào mức độ bổ sung giữa phân tử siRNA và mRNA, mRNA sẽ
bị im lặng (hoàn toàn) hoặc bị ức chế một phần.
Để các siRNA, miRNA được tổng hợp bên ngoài vào được hệ tuần hoàn
hoặc đến được mô đích chúng phải vượt qua được các rào cản ngoại – nội bào như:
+ Tránh bị bài tiết
+ Tránh các
nuclease
+ Tránh đáp ứng
miễn dịch
+ Thoát mạch
+ Tránh bị tế
bào hấp thu
+ Hình thành
endosome
1. Thiết kế siRNA
Thiết kế siRNA như trên hình là một sợi đôi với các vị trí gắn Argo,
TRBP như phần cơ chế có trình bày. Và chúng ta phải đảm bảo sao thiết kế siRNA
không tác động ngoài mục tiêu, chúng phải bắt cặp hoàn toàn với mRNA vì nếu
không siRNA có thể bắt cặp 1 phần trình tự seed như miRNA.
(1): siRNA: 19-21nu với 2 nu nhô ra ở đầu 3’: thường là TT và UU để
đảm bảo cho việc Argo có thể nhận dạng nó.
(2): ta biết siRNA phải được định hướng chính xác để gắn vào RISC để
sợi passenger bị loại bỏ còn sợi guide được giữ lại. Tuy nhiên cả 2 sợi này có
thể được nạp vào như sợi hướng dẫn cho nên cần 2 tham số chính:
+ Quy luật bất đối xứng: Dựa vào sự ổn định nhiệt động lực học tương
đối 2 đầu cuối 5’ của mạch đôi góp phần vào sự lựa chọn mạch guide nạp vào AGO.
Đầu 5’ kém ổn định (A/U cao) là sợi hướng dẫn còn đầu ổn định 5’ (G/C cao) là
sợi passenger
+ Ưu tiên nucleotide 5’: AGO ưa thích với mạch có một U hoặc A (ít
ưa thích hơn) ở vị trí cuối đầu 5’, còn C và G sẽ là sợi hành khách
(3): tỷ lệ G/C có ảnh hưởng đến hiệu quả của siRNA vẫn còn đang
tranh cãi nhưng có nhiều nghiên cứu chứng mình cho việc này.
Tác dụng ngoài mục tiêu siRNA: có thể gây chết tế bào, phổ biến nhất
là hiệu quả như miRNA.
+ Điều này xảy ra khi đầu cuối 5’ của sợi guide siRNA
bổ sung hoàn hảo với 3’UTR của
Slide 30
|
mRNA (gợi nhớ đến việc nhận
diện mục tiêu bởi vùng hạt giống miRNA)
+ siRNA chịu vài mismatches của mRNA (bắt cặp không hoàn hảo) mà
không làm giảm khả năng im lặng gen. Theo TH này siRNA hoạt động như miRNA
+ Do sự bão hòa của bộ máy
RNAi vì chúng sẽ cạnh tranh với miRNA nội sinh
à Để giảm điều này
chúng ta sẽ:
. Sử dụng Nồng
độ siRNA thấp nhất
. Kết hợp nhiều siRNA có nhiều trình tự à tuy nhiên có nghi vấn
sẽ khiến nguy cơ này tăng lên hơn.
. Tránh thiết kế các trình tự hạt giống của miRNA (2 – 7nu ở cuối
5’) siRNA có thể kích hoạt miễn dịch bẩm sinh:
+ Liên quan đến đường truyền tín hiệu PRK và con đường tín hiệu
TLR3. Sau này được trung gian bởi TLR 7 và TLR 8 trên các tế bào đuôi và bạch
cầu đơn, các thụ thể chuyển màng tế bào. hiện diện trong endosomes của các tế
bào miễn dịch à một vài trình tự kích thích miễn dịch: (5 'đến 3')
"GUCCUUCAA", "UGUGU", "UGU" và "UGGC"
và sự hiện diện của các chuỗi giàu U tương ứng với sự kích hoạt TLR 7/8
à Tránh các
trình tự tự này hay sử dụng các tác nhân phân phối không phải phân phối nội
bào siRNA hay biến đổi hóa học các trình tự này khiến chúng khôn thể nhận
diện bởi TLR. Tuy nhiên các quy tắc kích thích miễn dịch bởi trình tự chưa
được hiểu rõ nên cần kiểm tra cẩn thận.
Bảng tóm tắt về thiết kế siRNA
|
||||
Đặc điểm
siRNA
|
Chiến lược
|
Diễn giải
|
|||
Chọn lọc mạch
|
Áp dụng quy tắc bất đối xứng
Sử dụng ưu tiên nucleotide 5’
|
Mạch với một đầu kết thúc 5’ tương đối không ổn định được chọn làm
mạch hướng dẫn
Mạch với U hay A ở mạch đối diện vào đầu kết thúc 5’được ưu tiên
chọn là mạch
hướng dẫn
|
|||
Hoạt tính
|
Thao tác thành phần G/C
|
Thành phần G/C là 30-64%
G/C trải dài
>9 nu nên tránh
|
|||
Hiệu quả như miRNA
|
Tránh trình tự tương tự miRNA
|
siRNAs với các trình tự khác nhau để nhắm mục tiêu cùng mRNA
kết hợp để có hiệu quả điều
trị tốt.
Tránh các
trình tự hạt giống của miRNA đã
|
|||
Slide 31
Slide 32
Slide 33
|
được xác định
|
||||
Đáp ứng
miễn dịch
|
Tránh các motif đáp ứng
miễn dịch
|
Tránh trình tự giàu U và motif
có chứa:
GUCCUUCAA;
UGUU; UGU và UGGC
|
|||
2.
Thiết kế miRNA
So với siRNA, miRNAs có một ứng dụng điều trị rộng rãi hơn. Hơn
2.500 miRNA của con người đã được ghi lại trong miRBase (phiên bản 20 truy
cập vào tháng 6 năm 2015), một cơ sở dữ liệu miRNA trực tuyến có thể tìm
kiếm. Vì hơn 60% gen mã hóa protein của con người chứa ít nhất một vị trí
liên kết miRNA bảo tồn, cùng với sự hiện diện của nhiều vị trí không được bảo
tồn, phần lớn các gen mã hóa protein nằm dưới sự kiểm soát của miRNA.29 Sự
liên quan nhiều đến miRNAs trên nhiều bệnh của con người làm cho chúng trở
thành các mục tiêu hấp dẫn cho các chiến lược điều trị, cũng như các dấu hiệu
sinh học tiên lượng và tiên đoán. miRNAs tổng hợp (hoặc miRNA mimics) là để
đạt được các chức năng sinh học giống như miRNA nội sinh. Về lý thuyết, một
phân tử RNA đơn sợi có chứa chuỗi giống như sợi dẫn hướng của miRNA trưởng
thành có thể được chức năng như là miRNA bắt chước. Tuy nhiên, miRNA sợi đôi
có chứa cả đường dẫn hướng dẫn và hành khách đã được tìm thấy là mạnh hơn 100
đến 1.000 lần so với sợi đơn Cấu trúc đôi này có thể tạo điều kiện cho việc
nạp đúng phân tử RNA vào RISC, qua đó tăng cường hiệu ứng im lặng gen
Các tiền thân miRNA tổng hợp có trình tự dài hơn (từ một số ít
nucleotide tới pri-miRNA dài) cũng đã được đề xuất làm tác nhân điều trị. 78
Vì pri-miRNAs cần chế biến trong nhân, trong khi pre-miRNAs và miRNAs thì
không khác nhau các chiến lược được yêu cầu cho việc phân phối các loại miRNA
mimic khác nhau cho các mục tiêu tế bào.79 Tương tự như shRNA, các vec tơ
virus có thể được sử dụng để biểu hiện miRNA bên trong các tế bào. Bài tổng
quan này chỉ bàn về miRNAs được tổng hợp ngoại sinh.
Sự biến đổi hóa học: Vì sự biến đổi chuỗi cho miRNA điều trị có
giới hạn, sự biến đổi hóa học là cách tiếp cận chính để giải quyết vấn đề
này.
Một thiết kế điển hình cho miRNA, với các điểm trắng và đỏ nằm
lệch ra ngoài là các mismatch, những vị trí được các nhà khoa học ghi nhận là
gia tăng sự gắn và bắt của protein Argo
3. Thay đổi cấu trúc hóa học
Phosphate 5', phần gần đầu 5’, và các vị
trí trung tâm của mạch guide phản ánh các khu vực quan trọng của duplex RNA
cho sự tương tác và hoạt động của các protein RISC và AGO ít chịu được sự
biến đổi hóa học tại các địa điểm này.
Sự biến đổi hóa học ở toàn bộ
mạch passenger và phần gần đầu 3’ và nhô ra ở đầu 3’ ít ảnh
hưởng nhất
định đến tính đặc hiệu và/hoặc chức năng của RNA.
|
|||||
Slide 34
Slide 35
Slide 36
Slide 37
RNA dễ bị phân
hủy bởi nuclease trong máu à trở ngại với thuốc siRNA và miRNA
Sử dụng chiến lược biến đổi hóa học việc này giúp tăng tính bền, còn
góp phần tăng tính đặc hiệu, giảm khả năng đáp ứng và tác dụng ngoài mục tiêu.
-
Kiểu biến đổi đa dạng nhất và
cũng phổ biến nhất trong thiết kế duplex RNA, do hoạt động im lặng gen của siRNAs
hoặc miRNAs không phụ thuộc vào nhóm này
-
Tăng cường sự ổn định của
duplex RNA trong huyết thanh.
-
Đặc biệt, thay thế bằng 2'-O-Me
và 2'-F là hai sửa đổi rộng rãi nhất trong siRNA. Mặc dù những sửa đổi này nhìn
chung được dung nạp tốt ở hầu hết các vị trí siRNA, việc điều chỉnh rộng hoặc
đầy đủ có thể dẫn đến giảm hiệu quả của im lặng. Các thay thế 2'-O-Me và 2'-F
trong siRNA được thay thế hoàn toàn, siRNA kháng nuclease và mạnh có thể được
tạo ra.
-
2'-O-MOE có thể làm tăng sức đề
kháng nuclease, nhưng được dung nạp kém về mặt hoạt động.
Sử dụng Locked nucleid acid hay
unclocked
v
LNA:
+ Tăng đề kháng
lại nuclease
+ Sửa đổi ở đầu
5’ của sợi passenger khiến nó không kết hợp với RISC
+ Ngăn cản các
motif miễn dịch nhận diện bời TLR 7/8
+ Giảm hiệu quả
phân giải
v UNA:
+ Đơn UNA: Hiệu
quả im lặng và tính ổn định
+ Nhiều hơn
UNA, đặc biệt trong sợi Guide thì mất sự ổn định của sợi đôi, mRNA
+ UNA trong vùng hạt giống của sợi guide có thể ngăn chặn hiệu ứng
tác động ngoài mục tiêu giống miRNA mà không ảnh hưởng hoạt tính siRNA
Thay đổi backbone
Việc sửa đổi PS cũng thúc đẩy sự gắn kết protein huyết
tương, do đó làm giảm sự giải phóng bởi sự lọc cầu thận và bài tiết qua nước
tiểu, và do đó cải thiện thành thục dược động học của nucleotide.
Kỹ thuật này đã được sử dụng thành công trong thuốc antisense PS
fomivirsen , được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm chấp thuận vào cuối những
năm 90.104
Tuy nhiên, tăng độc tính và giảm sự im lặng của gen cũng được quan
sát. Điều này có thể bởi vì siRNAs, không giống như oligonucleotide antisense,
dung nạp chỉ có giới hạn sửa đổi để duy trì sự tương thích giữa RISC. Người ta
đã gợi ý rằng việc điều chỉnh PS ở trung tâm của duplex, đặc biệt là ở vị trí
phosphate khan hiếm, làm suy yếu hoạt động của RISC. Do đó,
Slide 38
Slide 39
Slide 40
một phần điều chỉnh PS đã được khuyến cáo, cùng với các kiểu sửa đổi
khác để tăng cường sức đề kháng exonuclease của siRNAs.
v Phosphorothioate
+ Được sử dụng
rộng rãi
+ Tăng sức đề
kháng với exonuclease
+ Sự gắn kết
protein huyết tương
v Boranophosphate
+ Có khả năng
kháng nuclease và ít độc hơn so với PS
+ Có thể giữ
lại hoạt tính sinh học của siRNAs vẫn cần được xác định
+ Việc áp dụng
trong miRNA vẫn chưa được nghiên cứu.
4. Phân phối thuốc RNAi
Làm sao có thể đưa siRNA và miRNA có thể đi vào cơ thể và đi đến vị
trí đích mà chúng ta mong muốn mà vẫn giữ nguyên hoạt tính
Có 2 chiến lược cung cấp RNAi
1.
Biểu hiện trong tế bào thông
qua việc đưa các vector biểu hiện vào bằng virus
2.
Tổng hợp các RNAi và đưa trực
tiếp từ bên ngoài vào
a.
Tổng hợp từ bên ngoài và có thể
được sản xuất với sự biến đổi hóa học (bảng giữa) - như 2'-Omethylpurines hoặc
2'-fluoropyrimidines tăng độ ổn định. Các siRNAs Dicer-chất nền bất đối xứng
cũng có thể được sản xuất (bên phải). Chúng có một đầu cùn bao gồm hai bazơ DNA
(D), trong khi đầu kia có một sự mở rộng 2-nt 3 '. Điều này đảm bảo rằng một
siRNA đơn được tạo ra bởi Dicer, trong đó xử lý kết thúc cùn. RNA kẹp tóc ngắn
tổng hợp dài hơn (shRNAs) cũng được xử lý như chất nền Dicer.
b.
Các biểu hiện trong tế bào
thông qua vector. Thúc đẩy mức biểu hiện shRNA cao từ promoter polymerase III
(Pol III) (bảng điều khiển bên trái). Các RNA kẹp tóc dài (lhRNAs) tạo ra nhiều
siRNA được xử lý bởi Dicer, cho thấy Dicer của động vật có vú là quá trình (M.
Sano và J.J.R., những quan sát chưa được công bố). Nhiều promoter Pol III riêng
biệt có thể được sử dụng trong một vector để thúc đẩy biểu hiện của một vài
shRNA khác nhau (bảng giữa). Các vector mang promoter Pol II hoặc Pol III tạo
ra các RNA tiền thân dài hơn, bao gồm các bản sao của shRNA polycistronic và
các mô phỏng viRNA (miRNA) được xử lý bởi cả Drosha và Dicer (bên phải).
Vận chuyển siRNAs. A| Tiếp cận không chọn lọc. Các nhóm cholesterol có thể được liên
kết với các RNAi bằng việc thay đổi về mặt hóa học nhỏ (siRNAs) cho hệ thống
phân phối (Aa). siRNAs cũng có thể được vận chuyển một cách có hệ thống bởi các
hạt lipid nucleic acid- lipid ổn định (Snalp) (Ab). B | Phương pháp chọn lọc.
Aptamer-siRNA chimaeras cho phép
Slide 41
Slide 42
Slide 43
|
siRNAs được chuyển đến các loại tế bào cụ thể biểu hiện thụ thể
được ghi nhận bởi aptamers (Ba và Bb). Một phương pháp tiếp cận mà tất cả RNA
có thể được sử dụng là ghép aptamers và siRNAs (Ba), hoặc dùng
biotin-streptavidin để hợp lại (Bb). Các đoạn chuỗi nặng kháng thể (Fabs) và
siRNAs có thể liên kết với protamine để phân phối siRNA tới các thụ thể đặc
hiệu trên bề mặt tế bào (Bc). Các hạt nano hiển thị các ligand đặc hiệu trên
bề mặt của chúng được sử dụng để nhắm mục tiêu các siRNA tới các loại tế bào đặc
biệt (Bd). PEG, polyethylene glycol.
Các vector có nguồn gốc từ adenoviruses hoặc AAVs được sử dụng để
biểu hiện ngắn hơn các shRNAs trong các chiến lược điều trị chống lại bệnh
ung thư và các bệnh khác, khi không đòi hỏi RNAi dài hạn. Những vector không
tích hợp này phần lớn vẫn còn nguyên vẹn, tích hợp ở tần số thấp, và truyền
tải ở cả tế bào phân chia và không phân chia với transgenes shRNA điều trị
(hình 6). Một trở ngại có thể có đối với các vector dựa trên adenovirus và
AAV là quản lý (administrations) lặp đi lặp lại có thể gây ra phản ứng miễn
dịch mạnh mẽ, do đó có khả năng giới hạn hiệu quả của chúng trong các thiết
lập điều trị nhất định.
Vận chuyển RNAi không dùng virus
Vận chuyển
Phương pháp Ưu điểm Khuyết
điểm nucleic acid
Cholesterol
siRNA Vận chuyển hệ thống, ổn định Không chọn lọc SNALP siRNA Vận chuyển hệ thống, rất ổn định
Không chọn lọc Fab siRNA Vận chuyển tới thụ thể đặc hiệu
Xây dựng tương
đối
phức tạp
Aptamer siRNA Vận chuyển tới thụ thể đặc hiệu
Cần phải kiểm tra
trình tự quy mô lớn
Nanoparticle siRNA Vận chuyển tới thụ thể đặc hiệu,
Chuẩn bị tinh vi
tự tập hợp
Phân phối shRNA bằng
virus. Vectơ lentivirus được sử dụng để cung cấp
các liệu pháp phân phối, gen biểu hiện RNA kẹp tóc ngắn (shRNA) được chuyển
gen và tích hợp vào bộ genonme để biểu hiện shRNA ổn định. Vector adenovirus
và liên qua adenovirus (VAA) không thành công trong việc tích hợp các gen
chuyển vào genome nhưng thay vào đó biểu hiện các shRNA episomally cho mức độ
biểu hiện shRNA ổn định vừa phải, cảm ứng phức hợp RISC (RNA-induced
silencing complex).
Vận chuyển RNAi dùng virus
|
||||
Phương pháp
|
Vận chuyển
|
Ưu điểm
|
Khuyết điểm
|
||
|
Slide 44
Slide 45
Slide 46
|
nucleic acid
|
||||
Lentivirus
|
RNA (sản phẩm
shRNA)
|
Biểu hiện ổn
định, truyền vào
các tế bào
không phân chia
|
Rủi ro phá vỡ
gen,
phân phối cục
bộ
|
||
Adenovirus
|
dsRNA (sản phẩm shRNA)
|
Episome, không có đột biến chèn
|
Gây đáp ứng miễn dịch, nhiễm độc gan
phụ thuộc vào liều
|
||
AAV
|
ss/dsRNA (sản phẩm shRNA)
|
Episome, tích
hợp gen thấp
|
Gây đáp ứng miễn dịch, chỉ có thể
mang vector nhỏ.
|
||
IV. Ví dụ
về thuốc nhắm mục tiêu RNAi
Khoảng những năm 2011, sử dụng interferon và ribavidin -> chỉ
khoảng 50% cho đáp ứng lâu dài về việc kháng virus, chủ yếu ở genotype 1
Sau đó phát triển các thuốc tác động trực tiếp vào virus, cụ thể
là thuốc phân tử nhỏ, nhắm mục tiêu vào các protein đặc trưng của HCV và hạn
chế được tối thiểu tác dụng phụ và đã được FDA cho phép sử dụng. Có 2 hướng,
một là nhắm tới các enzyme cần thiết để virus nhân bản là protease NS3-4A và
polymerase NS5B. Một hướng khác nhắm tới NS5A của việc lắp ráp virus hoàn
chỉnh, nhóm cuối cùng ức chế hoạt động của NS5B polymerase. Các thuốc này cho
đáp ứng kháng virus lâu dài tới 95% tuy nhiên cũng chỉ cho tác dụng ở
phenotype 1. tập trung vào miR-122, sử dụng oligonucleotide gọi là antagomiR
giúp knock down miRNA.
Cần loại
thuốc bao phủ hết các genotype HCV và đạt hiệu quả điều trị lâu dài.
Chu kỳ sống của HCV
HCV xâm nhập vào tế bào sẽ giải phóng RNA virus RNA ((+) RNA, đỏ)
vào tế bào chất. RNA (+) muốn hình thành virion mới trước hết phải tương tác
với ribosome trong mạng lưới nội chất (ER) để trải qua quá trình dịch mã tạo
ra các protein cần thiết cho việc lắp ráp các phức hợp nhân bản, các protein
này kết hợp với các protein có sẵn từ ER hình thành nên màng tế bào. Bên cạnh
đó cũng có sự tổng hợp RNA (-) từ sợi RNA (+), và sợi RNA (-) sẽ làm khuôn tổng hợp nhiều sợi RNA (+) mới. Những phân
tử RNA (+) mới này có thể được sử dụng tiếp tục để dịch mã tạo ra các protein.
Làm khuôn tổng hợp sợi (-) hay được đóng gói thành các viron mới, một số
chúng có thể bị phân hủy trong tế bào ví dụ như bị phân hủy bởi 5'-3
'exoribonuclease 1 (XRN1)
Hai quá
trình dịch mã (trái) và phiên mã (phải) không được diễn ra cũng một lúc.
Vai trò miR122 trong chu kỳ sống của HCV
Theo giả
thuyết, có sự điều chỉnh cân bằng giữa dịch mã và tổng hợp RNA. Chu kỳ của
HCV
|
|||||
Slide 47
Slide 48
Slide 49
dạng genome vòng chưa được biết rõ, nhưng người ta thấy
poly(rC)-binding protein 2 (PCBP2) đóng một vai trò quan trọng. Hình này mô tả
microRNA miR-122 và PCBP2 cùng điều chỉnh vòng genome HCV và do đó ảnh hưởng
đến sự tham gia của RNA trong các quá trình tổng hợp và dịch mã không cùng lúc
với nhau.
PCB2 hỗ trợ cho vị trí gắn của ribosome (IRES), tạo điều kiện cho
việc dịch mã bắt đầu từ vị trí IRES theo ciều 5’ – 3’và tăng cường việc tái sử
dụng tiêu đơn vị 40S sau khi hoàn thành một vòng dịch mã.
miR-122 cạnh tranh với PCBP2 gắn kêt vào vùng 5’UTR thúc đẩy sự mở
vòng, miR-122 cũng có thể gây ra những thay đổi trong cấu trúc của IRES. Dẫn
đến hỗ trợ tăng cường tổng hợp RNA (-) và tắt việc dịch mã, có thể do vùng đã
mở 3’UTR cho sự tương tác, sao chép RNA. miR-122 hoạt động liên kết vớ AGO2 bảo
vệ đầu 5’ của genome khỏi sự phân cắt của exoribonuclease 1 5’-3’ (XRN1).
Hình bên trái cho thấy vùng trình tự gắn kết giữa
miR-122 và đầu 5’UTR của RNA HCV
Cơ chế của Miravirsen
Miravirsen bắt đặt hiệu miR-122 dẫn đến ngăn cản việc gắn kết của
miR-122 lên RNA của HCV. Từ đó ức chế việc sinh tổng hợp mạch mới của genome
HCV, bất hoạt sự nhân lên của virus HCV.
Thiết kế trình tự ức chế miR-122
1.
Vùng mục tiêu là đầu 3’ của
miR-122 vì tầm quan trọng của vùng này bắt cặp với genome HCV, lựa chọn được
oligonucleotides bổ sung với vùng này và có kích thước 13 – 16 mer với nhiệt độ
nóng chảy ít nhất 60oC.. Sử dụng các locked nucleic acid để tăng
tính bền và tính đặc hiệu.
2.
Loại trừ các nucleotide bổ sung
cho các nucleotide đầu tiên miR-122 vì những nu này liên kết với pro Argonaute
và tránh sự bắt đặc hiệu ở vùng seed sẽ gây ra các đáp ứng ngoài mục tiêu.
3.
Để ngăn chặn khả năng cắt của
antimiR bởi phức hợp RISC, sửa đổi hóa học tại vị trí phân cắt sợi sense (passenger).
4.
Cuối cùng, để tăng cường tính
chất dược động học và cải thiện khả năng kháng nuclease, tất cả các antimiR
được tổng hợp với một backbone PS hoàn chỉnh và ưu tiên với sự biến đổi ở đầu
5’ và 3’.
Chọn lọc các
antimiR (Elmén et al., 2008)
Với 9 đoạn oligonucleotide được thiết kế và có độ dài khác nhau thực
hiện sàng lọc để chọn được mạch tối ưu nhất
Thực hiện clone vị trí gắn kết hoàn chỉnh với miR-122
ở 3’UTR của Renilla luciferase
Slide 50
Slide 51
Slide 52
reporter gene, sau đó đưa vào tế bào gan người Huh-7.
Phân tích khả năng gắn kết đặc hiệu với miR-122 của các oligonucleotide (5nm)
thông qua mức độ huỳnh quang và kết quả cho thấy, một đoạn 15-mer gọi là
SPC3649 (miravirsen) có nhiệt độ nóng chảy 80 độ cho ái lực cao, ức chế miR-122
mạnh với nồng độ thấp.
So sánh khả năng ức chế sự
sao chép HCV trong các tế bào Huh-7 có chứa replion
HCV NNeo/C-5B. Các oligonucleotides LNA-antimiR khác nhau với khả năng gắn kết
đặc hiệu và nhiệt độ nóng chảy từ thấp đến cao, cùng một oligonucleotide
2'-O-methyl (2'-OMe) bổ sung hoàn toàn (từ Jopling et al. ).
Kết quả cho thấy đoạn LNA-L9 ức chế sự sao chép HCV tốt nhất tương
ứng với nồng độ replicon HCV thấp nhất. L6 đứng thứ 2 và cuối cùng là L4, kết
quả này tương đồng với kết quả gắn kết đặc hiệu với miR-122 ở thí nghiệm trên.
Thử nghiệm tương tự với 2'-Ome, LNA-L9 và đoạn LNA-L9 có mismatch và
kết quả cũng cho thấy L9 có sự ức chế sao chép HCV.
Thử nghiệm trên động vật nhỏ - chuột (Elmén et al., 2008)
miR-122 có vai trò trong quan trọng quá trình sinh tổng hợp
cholesterol ở gan và huyết thanh, tác động vào quá trình oxy hóa axit béo,
miR-122 cũng có tính kháng viêm và chống hình thành khối u. Vì vậy cần phải xem
xét việc ức chế miR-122 có ảnh hưởng đến chức năng sinh học của miR-122 trong
vật chủ hay không.
1.
Thử nghiệm trên chuột với các
đoạn L4 và L9 với các nồng độ 1, 5, 25 mg/kg
Kết quả northern blot cho thấy đoạn L9 bắt đặc hiệu với miR-122 tốt
nhất tương ứng với vạch miR-122 nhạt dần và tăng ở vạch mạch đôi. Nồng độ
cholesterol trong máu giảm khi đưa L4, L9 vào chuột và mức giảm không đáng kể.
AldoA và Bckdk càng cao thể hiện gan bị thương tổn càng nhiều. L9 thể hiện mức
giảm AldoA và Bckdk cao khi sử dụng với nồng độ càng tăng, cho thấy sử dụng các
antimiR không gây ảnh hưởng tới gan.
2.
Thử nghiệm tương tự nhưng sử
dụng đoạn L9 và một antagomir từ báo cáo trước. Kết quả cũng cho thấy L9 có
hiệu quả cao trong việc bắt đặc hiệu với miR-122 và không ảnh hưởng nhiều tới
chức năng của miR-122 trong sinh tổng hợp cholesterol (nồng độ cholesterol
trong máu không có ảnh hưởng lớn), cũng như là đối với AldoA và Bckdk.
Thử nghiệm trên động vật lớn –
tinh tinh (Lanford et al., 2010)
Thử nghiệm với liều cao 5mg/kg với nồng độ HCV ban đầu khoảng từ 105
– 106 Thử nghiệm với liều
cao 1mg/kg với nồng độ HCV ban đầu khoảng từ 104 – 105
Không thấy các phản ứng phụ ở động vật được điều trị. Điều quan
trọng không phát hiện sự gia tăng virus trong giai đoạn điều trị 12 tuần.
Kiểm tra virus có những thay đổi dẫn đến kháng thuốc
khi điều trị với miravisen. Thực hiện
Slide 53
Slide 54
Slide 55
Slide 57
phân tích trình tự vị trí bắt cặp miR-122 ở vủng 5’UTR của RNA HCV
trong các giai đoạn ban đầu, kết thúc điều trị, khi virus tái phát trở lại và
kết thúc theo dõi. Kết quả cho thấy không có đột biến thích nghi ở hai vị trí
lai miR-122 và 5’UTR, cho thấy vùng này có tính bảo tồn cao và miravirsen có
rào cản cao đối với khả năng kháng virus.
Khả năng sử dụng cho tất cả các genotype
Lanford et al., 2010, so sánh vùng trình tự của hai vị
trí lai giữa HCV 5’UTR và miR-122 ở tất cả các genotype HCV cho thấy vùng trình
tự này tương đồng bảo tồn giữa các genotype HCV.
Năm 2011, Li et al thực hiện và xác nhận hai vùng trình tự này tương
đồng giữa các genotype HCV.
Khả năng gắn kết của miravirsen
Miravirsen (SPC3649) gắn kết ức chế hoạt động của miR-122.
Pri-miR-122 được xử lý bởi Drosha để hình thành pre-miR-122, sau đó lần lượt
được xử lý bởi Dicer và gắn kết miRISC. Miravirsen (SPC3649) có khả năng gắn
kết vào cấu trúc vòng lặp gốc của pri-miRNA cũng như pre-miRNA, và cũng có thể
gắn kết với miRNA trưởng thành.
Vận chuyển – Phân phối Miravirsen
Các
oligonucleotide LNA thường sử dụng các hạt nhỏ để vận chuyển
Chiến lược vận chuyển của miravirsen không được tìm thấy tuy nhiên
nó có thể giống với cơ chế vận chuyển của một thuốc RNAi cũng nhắm trúng đích
tới gan như sau:
Các hạt lipid được phủ ligand với các thụ thể ApoE trong tế bào gan
và được nhập bào. Các hạt lipid này sẽ được tích điện tích dương do pH axit của
túi nội bào. Các hạt nano tích điện dương sẽ liên kết với màng nội bào tích
điện tích âm dẫn đến sự dung hợp của các màng cuối cùng sẽ giải phóng siRNA vào
bào tương tế bào.
Trả lời câu hỏi RNAi bị điều hòa
bởi yếu tố nào?
Cảm ứng biểu
hiện RNAi
Cơ chế tế bào
phát hiện ss/ds RNA của virus tùy thuộc vào loại tế bào.
Đối với tế bào không phải tế bào miễn dịch (ở bên trái) phát hiện
các oligonucleotide virus nhờ RIG-I (đối với RNA 5’triphosphate) và MDA-5 (đối
với dsDNA) và được điều hòa bởi LGP2. CARDIF kích hoạt sự kích hoạt của RIG-I,
kết quả là kích hoạt các yếu tố phiên mã. Đối với tế bào miễn dịch (ở bên phải)
nhận diện ss/ds RNA bởi TLR. Thông qua kích hoạt và thu hút các adaptor (TRIF
và MyD88), TRL3, 7 và 8 kích hoạt IRFs và các yếu tố phiên mã NF-κB.
=> Các nhân tố phiên mã này tạo ra sự biểu hiện của IFN và cytokine
gây viêm. Song song đó, phiên mã tạo các dsRNA nội sinh từ đó hình thành
pri-miRNA, pre-miRNA và cuối cùng
Slide 58
|
là miRNA
Ức chế con đường RNAi
Virus mã hoá
các protein chuyên dụng để chống lại RNAi.
Sự nhân đôi của virus dễ bị tấn công bởi RNAi, vì các dsRNA xuất
hiện trong quá trình nhân đôi của virus có thể bị nhận biết bởi Dicer. Do đó,
virus mã hóa các protein chống lại RNAi để bảo vệ RNA virus không bị phân
hủy. Các protein này can thiệp vào con đường RNAi trong tế bào vật chủ, như
gắn vào phức hợp protein cắt dsRNA (Dicer), gắn vào dsRNA hoặc siRNA, ngăn
cản việc lắp ráp phức hợp cảm ứng im lặng gen (AGO-containing silencing
complex), ức chế việc tạo thành siRNA.
Các virus RNA và DNA xâm nhiễm vào thực vật, côn trùng, cá hoặc
động vật biến nhiệt mã hóa các enzym RNaseIII Class1 (giống protein
endonuclease). Hoạt tính enzyme endonuclease đặc hiệu dsRNA (RNaseIII) của
iridovirus trong cá tráp (rock bream) xâm nhiễm cá và Sweet potato chlorotic
stunt crinivirus (SPCSV) xâm nhiễm thực vật đã biết. Sự ức chế con đường RNAi
chống lại virus của vật chủ của RNaseIII ở SPCSV và virus Heliothis virescens
ascovirus xâm nhiễm côn trùng đã được chứng minh. Ức chế RNAi của các enzym
RNaseIII Class1 virus trong các sinh vật không phải vật chủ vẫn chưa được tìm
hiểu.
PPR3, một enzym RNaseIII của Pike-perch iridovirus, ức chế RNAi
trong các loài không phải vật chủ như Nicotiana
benthamiana (thực vật) và Caenorhabditis
elegans (tuyến trùng). Sự ức chế RNAi bị suy giảm khi hoạt tính xúc tác
của PPR3 bị giảm.
Enzym RNaseIII (CSR3) của SPCSV không ức chế được RNAi (cảm ứng
bởi ssRNA) trong C.elegans. Trong
lá N. benthamiana, PPR3 ức chế RNAi
cảm ứng bởi dsRNA và ssRNA, và đảo ngược được sự im lặng gen; nhưng CSR3 chỉ
ức chế RNAi cảm ứng bởi ssRNA và không đảo ngược được sự im lặng gen.
Cả PPR3 cà
CSR3 đều không ức chế được RNAi trong Drosophila
melanogaster.
Những kết quả này cho thấy các enzym
RNaseIII của RNA và DNA virus ức chế RNAi phải có hoạt tính xúc tác. Khác với
các protein virus ức chế sự im lặng gen, các enzyme RNaseIII tương đồng trong
các virus RNA và DNA không liên quan và có thể được phát hiện trong bộ gen
virus bằng cách sử dụng các chương trình dự bóa sự biến đổi gen và cấu trúc
protein.
TLTK: Suppression of RNAi by dsRNA-Degrading RNaseIII Enzymes of Viruses
in Animals and Plants
(http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1004711#sec006)
|